RNA 產(chǎn)品應用
Oplr16 通過多能特異性染色體環(huán)和 TET2 介導的 DNA 去甲基化來調(diào)控干細胞的命運
Oplr16 Serves as a Novel Chromatin Factor to Control Stem Cell Fate by Modulating Pluripotency-Specific Chromosomal Looping and TET2-mediated DNA Demethylation
發(fā)表期刊
Nucleic Acids Research
影響因子
IF=11.15
發(fā)表期刊位置
中科院雜志分區(qū) 1 區(qū)
通訊作者所在單位
吉林大學第一醫(yī)院
伯豪生物提供的產(chǎn)品或服務
伯豪生物 RNA 測序
研究路線
圖 A 研究路線圖
主要結(jié)果
1、確定了 Oplr16 是多能干性相關 lncRNA，進行亞細胞定位，同時證明 Oplr16 是維持干細胞多能性所必需的
潛在的多能性相關的 lncRNA 應滿足兩個標準能力，首先，具有調(diào)節(jié)干細胞核心因子基因例如 Oct4，Sox2 和 Nanog 的能力。其次，響應多能性狀態(tài)而差異表達。本文作者提出了一種新穎的策略來尋找滿足這兩個標準的潛在 lncRNA。使用染色質(zhì) RNA 原位逆轉(zhuǎn)錄測序（CRIST-seq）方法確定哪些 lncRNA 與 Oct4 啟動子相互作用，然后使用常規(guī)的 RNA 轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）來鑒定可能與多能性重編程相關的差異表達的 lncRNA。RNA-seq 用于鑒定在重編程過程中收集的成纖維細胞和 iPSC 之間差異表達的 RNA。進一步鑒定 Oplr16 是多能性相關的 lncRNA。作者分離了細胞質(zhì)和核 RNA 進行亞細胞分級測定。RT-PCR 顯示，Oplr16 主要位于細胞核中（圖 1C）。RNA-FISH 分析也驗證了其在 iPSC 中的核定位（圖 1D）。這些結(jié)果表明 Oplr16 是在體細胞重編程過程中被激活的小鼠核 lncRNA。
為了確定 Oplr16 在多能性中的作用，作者收集了擬胚體分化過程的不同時間的細胞利用用 qPCR 方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn) Oplr16 與多能性狀態(tài)呈正相關，在擬胚體分化過程中與 Oct4，Sox2 和 Nanog 具有相似的表達模式。
2、RNA 逆轉(zhuǎn)錄相關捕獲測序（RAT-seq）
使用 RNA 逆轉(zhuǎn)錄相關陷阱測序（RAT-seq）方法來分析 Oplr16 的靶基因。分析顯示 Octr16 在 Oct4 基因座富集，在啟動子區(qū)域有一個峰，對照大鼠在該基因座處未顯示結(jié)合峰。定量 PCR 也顯示 Oplr16 在 Oct4 的啟動子區(qū)域富集。
3、染色體構象捕獲技術（3C）發(fā)現(xiàn) Oplr16 通過招募 SMC1 維持染色質(zhì)的內(nèi)環(huán)結(jié)構
研究團隊先前已發(fā)現(xiàn)了啟動子 - 增強型染色體內(nèi)環(huán)結(jié)構，對于啟動和維持干細胞多能性至關重要。本研究也使用染色質(zhì)構象捕獲（3C）的方法驗證 Oplr16 是否參與該染色質(zhì)內(nèi)環(huán)，結(jié)果檢測到 E14 細胞的多能性相關 3C 環(huán)，但敲除 Oplr16 可以改變這種染色體內(nèi)環(huán)結(jié)構。使用 SMC1 RNA 染色質(zhì)免疫沉淀（RIP）分析 Oplr16 與 SMC1 相互作用。
4、甲基化分析 Oplr16 招募 TET2 誘導成纖維細胞 DNA 去甲基化并激活 Oct4，增強重編程。
啟動子甲基化分析檢測 Osclr8 對 Oct4 啟動子甲基化是否有保護作用，另通過 RT-PCR 方法檢測重編程過程中 3 種 TET 的表達，應用 lncRNA 染色質(zhì)免疫共沉淀方法檢測 TET 蛋白是否與 Oplr16 結(jié)合明確 lncRNA Oplr16 與 TET 結(jié)合片段。
本文結(jié)論
多能特異性染色質(zhì)網(wǎng)絡的形成是體細胞重編程為多能性狀態(tài)的關鍵。研究人員利用“染色質(zhì) RNA 原位逆轉(zhuǎn)錄測序”（CRIST-SEQ) 分析了與多潛能主控基因 Oct4 相互作用的 RNA 成分，研究發(fā)現(xiàn)了核 lncRNA Oplr16 與重編程的啟動密切相關。Oplr16 不僅與 Oct4 的啟動子相互作用調(diào)節(jié)其活性，還在重編程為多能性的過程中被特異性激活，激活表達的 Oplr16 是胚胎干細胞維持多能性所必需的，Oplr16 還能促進成纖維細胞重編程為多能細胞。RNA 逆轉(zhuǎn)錄相關的 TRAP 測序（RAT-SEQ) 結(jié)果表明，Oplr16 與多個與干細胞自我更新相關的靶基因相互作用。Oplr16 利用其 3’端片段招募染色質(zhì)因子 SMC1 來調(diào)控多能特異性染色體內(nèi)環(huán)結(jié)構的形成。在與 Oct4 啟動子結(jié)合后，Oplr16 招募 TET2 誘導成纖維細胞 DNA 去甲基化并激活 Oct4，增強重編程。這些研究數(shù)據(jù)表明 Oplr16 作為一個關鍵的染色質(zhì)因子可能通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構和 DNA 去甲基化來調(diào)控干細胞的命運。
微信原文：https://mp.weixin.qq.com/s/eZaKiF5l4aKOv-o2i-6NhA
